EN难表达蛋白（DEPs）包括类毒素、酶、膜蛋白（MPs）、抗体以及一些在原核表达系统中溶解性较差的蛋白质。DEPs目前已被开发用作治疗性蛋白质，如药物载体、抗体、抗菌剂和疫苗等[1]。因为大肠杆菌系统相对简单且成本较低，因此在DEPs的生产中广泛使用。然而，蛋白质固有的低溶解性、低产量、结构不稳定性和宿主毒性等许多问题仍然存在。DEPs的水溶性和稳定性主要取决于其折叠稳态和蛋白质质量控制（PQC），一些错误折叠的蛋白质可能会绕过蛋白质稳态机制并在体内保持可溶性形式[2]。
近日，发表于《Metabolic Engineering》期刊的综述Improving the soluble expression of difficult-to-express proteins in prokaryotic expression system via protein engineering and synthetic biology strategies[3]，探讨了通过蛋白质工程和合成生物学策略提高原核表达系统中难表达蛋白（DEPs）可溶性表达的最新进展。文章概述了影响蛋白质正确折叠的关键因素和折叠机制，总结了提升DEPs可溶性表达的蛋白质工程先进技术和工具、蛋白质质量控制系统、原核表达系统的再设计以及无细胞表达技术的进展。
改善DEPs的可溶性表达的方式
? 蛋白工程技术
实现蛋白质功能的关键前提之一是将蛋白质折叠成正确的三维结构，折叠过程是一个自组装过程，即蛋白质从一个展开状态到自然状态，这一过程最主要由氨基酸序列决定。截至目前已经探索了许多基于进化和理性设计的蛋白质工程方法，致力于重新设计DEPs的氨基酸序列，以在功能干扰最小的情况下提高蛋白质折叠稳定性。氨基酸的电荷、极性及与周围分子的相互作用，以及pH值、温度、金属离子、辅因子和表面活性剂，都是影响蛋白质在水中或膜中表观稳定性的关键因素[4]。
另一种传统方法是定点突变，它是用于理性修饰DEPs序列的最广泛使用的工程方法，通过插入、删除或替换关键残基来进行改造[5]。通过识别暴露于溶剂中的非功能性疏水残基并将其替换为亲水残基，可以增加表面极性相互作用，从而减少其空间聚集倾向。如图1所示，目前研究出的一项QTY code 技术、基于噬菌体辅助定向进化技术和蛋白质序列理性设计PROSS等方法。
图1. 用于提高DEPs溶解度的蛋白质工程代表性技术
?融合可溶性标签
另一种广泛用于获得可溶性蛋白质的策略是融合可溶性标签，可以同时提高DEPs的溶解度和产量。可溶性标签，如谷胱甘肽转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、小分子类泛素修饰蛋白（SUMO）和Fh8，已经被广泛用于在原核宿主中表达时提高DEPs的可溶性形式。同时，融合伙伴还赋予了异源蛋白额外的特性，如蛋白质免疫检测、定量以及蛋白质-蛋白质相互作用[6]。
?转录和翻译元件的优化
蛋白质折叠是一个高度动态的过程，其中翻译延伸的速度和共翻译中发生的不同相互作用在蛋白质折叠中起着重要作用，核糖体停滞可导致核糖体解离和不完全蛋白的降解。DEPs的生产也可以在多个水平上调节，包括转录、翻译和共翻译折叠水平上调控[7]。
密码子优化技术侧重于通过改变低丰度密码子来缓解翻译延伸瓶颈，利用密码子适应指数（CAI）进行评估。研究人员通常会通过调整GC含量和关闭的核糖体结合位点（RBS）序列来消除稀有密码子，并避免形成发夹结构[8]。
图2.转录和翻译元件优化
?共表达分子伴侣和蛋白质质量控制（PQC）系统
尽管融合可溶性标签的开发和应用已经相当全面，但并非所有目标蛋白的溶解表现都一致。因此，伴侣蛋白、触发因子、解聚酶和二硫键异构酶的共表达被广泛应用作为一种补充方法，以提高DEPs的稳定性和溶解性[9]。
伴侣蛋白的主要功能是识别折叠的中间体或错误折叠的蛋白质，并为与细胞质分离提供折叠环境。胞质伴侣系统GroEL-GroES和DnaK-DnaJ-GrpE的研究最为深入，伴侣的结构基础和辅助折叠机制也得到了深入研究[10]。
微生物还依赖于伴侣蛋白和PQC系统来识别并促进可溶性错误折叠蛋白质的清除。细胞保护性PQC系统已经进化出选择性识别和减少错误折叠蛋白毒性效应的能力，以维持蛋白质稳态。因此，这些非功能性蛋白质必须通过细菌中的各种PQC系统降解，例如ClpAP和ClpXP复合物[11]。
图3. 伴侣蛋白和蛋白质质量控制（PQC）系统的共表达
?DEPs表达平台的工程化设计
难表达蛋白难表达蛋白质（DEPs）的可溶性表达失败，即便对于已充分表征的蛋白质，也可能导致微生物细胞工厂的表现不理想，进而造成研究和生产上的低效或无效尝试。这一问题可以通过表达宿主筛选和底盘重构来克服。
此外，可通过适应性实验室进化筛选突变株来高效生产DEPs。这种方法不需要对导致细菌表型变化所需的突变类型进行深入了解，但可以通过丰富的自然选择和更高适应度的突变来实现菌株优化，如突变体C43(DE3)、Mutant56(DE3)等[12]。
自适应实验室进化可以在全基因组培养物中引发自适应随机突变，从而促进细菌的活跃生长，随后通过筛选，选择出具有比原始菌株更好生长特性的目标表型突变体。
图4. 用于DEPs表达的工程化菌株概述
?无细胞表达（CFE）技术
基于细胞的重组蛋白表达有时会受到异源蛋白对宿主的毒性以及蛋白酶降解的限制。CFE系统作为一种替代技术，可以避免活细胞表达系统的局限性。在这种系统中，蛋白质合成可以通过细胞提取物中的转录和翻译机制启动，并补充翻译所需的底物、DNA模板和能量底物[13]。
图5. 无细胞表达工作流程
总结与展望
综上，原核表达系统在可扩展且经济高效地生产高质量重组蛋白方面展现出显著的潜力。通过对蛋白质折叠机制的深入理解，结合多种优化方法，如培养基的选择、发酵参数的调整，以及先进的合成生物学工具，可以显著改善DEPs的溶解性和稳定性。然而，由于DEPs在结构、物种来源和内部特性上的多样性，不同方法的联合使用往往比单一策略更为有效。此外，随着机器学习、深度学习以及基于非天然氨基酸的新技术的应用，下一代细胞工厂和无细胞表达系统有望进一步提升蛋白质生产的效率和质量。这些综合策略为DEPs的规模化生产提供了重要的新途径。
展望未来，随着新工具的应用、基于深度学习的算法开发和非天然氨基酸的引入，可以预期将进一步扩展对蛋白质的全新设计和多样化能力。鉴于计算生物学日益受到关注，基于深度学习的结构预测、蛋白质设计以及基因组规模的代谢模型已经成为最近的研究热点。例如，随着蛋白质结构预测领域的进展，通过准确识别蛋白质表面热点区域的减少，可以在不影响核心相互作用或不冒结构崩塌风险的情况下提高蛋白质的溶解性。另一方面，新型代谢网络模型的出现有望实现具有高效表达能力的下一代细胞工厂。
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